結(jié)合工作實(shí)踐，對微生物限度檢查方法驗(yàn)證過程中的問題進(jìn)行分析，并提出合理化建議，以使驗(yàn)證方法能保證污染供試品的微生物被充分檢出。

　　為使微生物限度檢查方法更加科學(xué)、完整，2005年版《中國藥典》規(guī)定：在建立供試品的微生物限度檢查法或檢查法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時，應(yīng)對檢查法的可靠性進(jìn)行方法驗(yàn)證，，在其供試品3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，細(xì)菌、霉菌及酵母菌的回 收率均應(yīng)達(dá)70%以上，控制菌檢查方法驗(yàn)證的試驗(yàn)組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，陰性菌對照組不得檢出，否則不符合驗(yàn)證試驗(yàn)要求，應(yīng)建立新方法并重新驗(yàn)證。但方法驗(yàn)證周期長，程序煩瑣，干擾因素多，若控制不當(dāng)則難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。影響微生物限度檢查方法驗(yàn)證結(jié)果有哪些因素？現(xiàn)就方法驗(yàn)證過程中易影響結(jié)果的幾個原因分析如下。

　　1、藥品的抑菌或殺菌性成分

　　筆者在口服中成藥和西藥的微生物限度檢查中發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)多的品種(如三黃片、牛黃解毒片、阿加盼散、維生素B2片等)具有抑菌作用，其微生物限度檢驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確，主要取決于供試品本身在試驗(yàn)條件下是否抑制被檢微生物的生長繁殖。在檢驗(yàn)前或檢驗(yàn)過程中，應(yīng)排除其抑菌作用，使之不干擾微生物限度檢查，這樣所得結(jié)果才有效。

　　對于供試藥品的抑菌性，國外藥典規(guī)定在檢查前先通過試驗(yàn)加以確定，并對供試品進(jìn)行處理，消除抑菌作用影響后再進(jìn)行檢查。在我國藥典中，供試藥品的抑菌性是根據(jù)不同稀釋度的菌數(shù)變化和控制菌的陽性對照試驗(yàn)是否正常生長來判斷的。 在試驗(yàn)中，低稀釋級抑制菌不生長或少生長而高稀釋級才生長的情況并不少見，這給方法驗(yàn)證帶來了難度。

　　2005年版《中國藥典》的方法驗(yàn)證一般是采用最低稀釋級的供試液對規(guī)定菌株進(jìn)行逐一驗(yàn)證，但若抑菌作用未消除或消除不完全，其回收率就很難達(dá)到要求。因此，在方法驗(yàn)證前判定供試藥品是否存在抑菌或殺菌性是方法驗(yàn)證是否成功的關(guān)鍵因素之一。在試驗(yàn)前應(yīng)先對供試藥品處方進(jìn)行分析，然后作預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果采用最簡單、最易操作的方法進(jìn)行驗(yàn)證。如選擇標(biāo)準(zhǔn)上所規(guī)定的方法消除最低稀釋級的供試液的抑菌活性，仍不能使試驗(yàn)菌的回收率達(dá)到方法驗(yàn)證的要求時，應(yīng)根據(jù)供試品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，采用高一級稀釋供試液重新進(jìn)行回收率測定，當(dāng)試驗(yàn)菌的回收率達(dá)到計數(shù)方法驗(yàn)證的要求時，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液。

　　2、標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存及菌液的制備、貯期

　　藥品微生物限度檢查對象具有以下特征：屬能繁殖的活細(xì)胞生物，活性易變性;數(shù)量少且分布不均勻;多數(shù)處于受損狀態(tài);生存 環(huán)境具多樣性及復(fù)雜性。驗(yàn)證試驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株形態(tài)變異、 菌落變異、耐藥性變異等均可使細(xì)菌叢集或分散不均，從而造成計數(shù)誤差大，影響驗(yàn)證結(jié)果。

　　因此，在方法驗(yàn)證中所采用的標(biāo)準(zhǔn)菌株其生物學(xué)特性必須典型、穩(wěn)定，對試驗(yàn)菌種的保存，應(yīng)采用適宜的方法和技術(shù)，以防試驗(yàn)菌株變異，所用菌種的傳代次數(shù)按規(guī)定不得超過5代，所制備的菌液貯期不能太長，菌數(shù)應(yīng)達(dá)到藥典要求。

　　3、操作環(huán)境不符合規(guī)定

　　按微生物限度檢查要求，無菌室應(yīng)由無菌操作間和兩個緩沖間組成，操作間與緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞箱，操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對，每個無菌室應(yīng)有獨(dú)立的空氣凈化系統(tǒng);環(huán)境潔凈度不應(yīng) 低于10000級，其操作點(diǎn)或凈化工作臺的凈化級別應(yīng)達(dá)到100級。 筆者曾發(fā)現(xiàn)，在凈化工作臺啟動的情況下，有3批同一樣品在驗(yàn)證試驗(yàn)中回收率重現(xiàn)性差，后經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)是凈化工作臺不合格造成 的。因此，應(yīng)加強(qiáng)無菌室的清潔、維護(hù)和保養(yǎng)工作，定期檢測元菌操作臺及凈化工作臺的潔凈度，對不合格者應(yīng)及時處理。

　　4、操作誤差

　　操作不熟練，實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)控制不嚴(yán)格，或?qū)嶒?yàn)操作不夠嚴(yán)謹(jǐn)，均會給試驗(yàn)結(jié)果帶來很大影響。如放供試液或菌液入皿時每1 mL未完全放盡;所加菌液計數(shù)不準(zhǔn)確;在驗(yàn)證細(xì)菌、霉茵及酵母菌計數(shù) 方法時，樣品及菌液注皿后未立即傾注培養(yǎng)基，由于樣品的活性作用造成前面的平皿與后面的平皿的細(xì)菌誤差大。

　　因此，在操作中， 所取制備菌液的單位體積菌數(shù)比標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要稍高些，以減少加在樣品中的菌液體積。應(yīng)將0.4-0.6mL菌液加在平皿中部，避免其流動，然后立即加入培養(yǎng)基，最好有兩人操作，以減少皿與皿間的試驗(yàn)菌數(shù)誤差。

　　5、培養(yǎng)基靈敏度下降

　　為了方便，很多單位在試驗(yàn)中都使用干粉培養(yǎng)基，但干粉培養(yǎng)基極易吸潮，存放不當(dāng)會出現(xiàn)凝塊，使凝固性變差，所以，要注意干粉培養(yǎng)基的貯存和保管。用電爐直火加熱熔化培養(yǎng)基或?qū)⑹Ｓ嗟?培養(yǎng)基冷藏后再熔化使用，均很容易破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，并直接影響菌回收率。

　　6、滅菌方法不當(dāng)

　　高壓消毒滅菌法是最常用、最有效的滅菌方法。為了保證高壓滅菌的質(zhì)量，達(dá)到高壓消毒的目的，在進(jìn)行高壓滅菌消毒時，首先要選擇合格的壓力蒸氣滅菌器，其次操作人員必須了解滅菌器的原理并遵守其操作規(guī)程，選擇經(jīng)驗(yàn)證合格的滅菌程序。消毒時要特別注意排盡鍋內(nèi)的冷空氣，否則壓力雖然達(dá)到了要求，溫度卻達(dá)不到要求，滅菌就可能不徹底。

　　同時，應(yīng)根據(jù)消毒物品的特性確定合理的滅菌時間和溫度： 一般情況下，含有糖分的培養(yǎng)基溫度須控制在 115℃，保持15-20min：不含糖分的培養(yǎng)基溫度應(yīng)控制在121℃， 保持15-20min;而含菌的培養(yǎng)基(使用過的)溫度須控制在121℃， 保持30min左右。每次使用時，都應(yīng)有必要的監(jiān)視指標(biāo)。

　　7、菌落計數(shù)誤差

　　在方法驗(yàn)證中，對試驗(yàn)菌組的菌落計數(shù)應(yīng)仔細(xì)觀察，對供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等要嚴(yán)格區(qū)分，對可影響計數(shù)的供試品， 在進(jìn)行方法驗(yàn)證前，應(yīng)先將對結(jié)果有影響的藥渣除掉。

　　總之，對藥品的微生物限度檢查，應(yīng)采用經(jīng)過驗(yàn)證的方法，且操作者須有一定的理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，嚴(yán)格按操作規(guī)范進(jìn)行，這樣才能減少或避免對方法驗(yàn)證結(jié)果造成的誤差。